Abstract The quality of the raw material for chocolate manufacture depends on the control of cacao seed fermentation. Practices affect the diversity and metabolic activities of spontaneous yeasts in fermentations. The control of the initial inoculum is important to standardize fermentations and to improve the final seed quality. We conducted fermentations using non-cleaned or cleaned fermentation boxes to evaluate the dynamics of the microorganism populations and their effect in seed composition in two consecutive years. The isolated yeasts were identified by sequencing the D1-domain of the 26S ribosomal genes. Pulp and cotyledon parameters were monitored during fermentations. Wickerhamomyces anomalus was the dominant yeast in the fermentations, but the species was less represented in cleaned boxes. In the cleaned-box fermentation, there was a delay in temperature rise of the fermentation, which retarded the suitable moment for seed-mass turning. The reduction in seed-pulp quality caused by restricted rainfall in one year limited the seed-mass heating and voided the seed turning. Thus, under substrate restriction, the initial reduced inoculum caused by cleaning the boxes impaired fermentation, mainly under environmental conditions that compromise the quality of the pulp. However, this variation had little effect on the desired degradation of cotyledon components, substrates for flavor precursors. noncleaned non years D1domain Ddomain D1 domain D S genes cleanedbox box seedmass mass turning seedpulp pulp Thus restriction However components precursors

O objetivo da presente pesquisa foi analisar os graus de polimorfismos protéicos entre isolados de C. albicans provenientes de diversos sítios anatômicos de quarenta e dois pacientes clínicos, através do emprego da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e análise numérica, a fim de se identificar subespécies e suas similaridades nos diversos nichos infecciosos. Culturas celulares foram desenvolvidas em meio YEPD, coletadas por centrifugação e lavadas com solução salina gelada. As proteínas celulares totais, foram extraídas por rompimento celular, usando pérolas de vidro e submetidas à técnica de SDS-PAGE. Após a eletroforese, as bandas de proteínas foram coradas com coomassie-blue e analisadas pelo conjunto de programas estatístico NTSYS-pc versão 1,70. Matrizes de similaridade e dendrogramas foram gerados pela aplicação do coeficiente de similaridade simple-matching e do algoritmo UPGMA, respectivamente. Os resultados obtidos revelaram vários subtipos de C. albicans e seus graus de similaridade (80% a 100%). Tais dados permitiram demonstrar que, certos pacientes podem estar infectados com dois ou mais subtipos de C. albicans em determinados sítios anatômicos (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue ou secreção traqueal), ou ainda, dois ou mais pacientes podem estar infectados em sítios anatômicos idênticos (i.e. apenas em lavagem brônquica, urina, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal ou saliva saudável) com um mesmo subtipo de C. albicans. No entanto, dois ou mais pacientes também podem apresentar infecções em sítios correspondentes (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue, secreção orofaríngea, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal e saliva saudável) por diferentes subtipos de C. albicans. Além disso, dois ou mais pacientes também podem estar infectados com subtipos idênticos ou não de C. albicans em diferentes sítios anatômicos (i.e.1. idênticos subtipos na secreção vaginal, secreção traqueal e urina; secreção abdominal e escarro; drenagem e cavidade oral; cateter e saliva saudável - i.e.2. diferentes subtipos em lavagem brônquica, secreção orofaríngea, secreção pulmonar, cavidade oral de pacientes imunocomprometidos e sangue). Dados complementares envolvendo amostras de C. albicans isoladas de vários sítios anatômicos de pacientes imunocompetentes ou imunocomprometidos (antes, durante e após terapias específicas) e seus familiares ou trabalhadores hospitalares, deverão ser obtidos a fim de se estabelecer as possíveis fontes de colonização por esses microrganismos. De modo geral, os perfis de proteínas totais obtidos por SDS-PAGE associados com análise numérica computadorizada, permitem a obtenção de critérios adicionais para os estudos epidemiológicos e taxonômicos de C. albicans.

The aim of the present research was to evaluate the protein polymorphism degrees among forty-eight C. albicans isolates from fourteen anatomical sites of clinical patients by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and numerical analyzes, in order to identify subspecies and their similarities in some infectious niches. Cell cultures were grown in YEPD medium, collected by centrifugation, and washed in cold saline solution. The whole-cell proteins were extracted by cell disruption using glass beads and submitted to SDS-PAGE technique. After electrophoresis, the protein bands were stained with coomassie-blue and analyzed by statistics package NTSYS-pc version 1.70 software. Similarity matrixes and dendrograms were generated by application of similarity coefficient of simple matching and UPGMA algorithm, respectively. The results obtained showed several C. albicans subtypes and their similarity degrees (80% to 100%). Such data showed that same patients may be infected by two or more C. albicans subtypes in certain anatomical sites (i.e. only in oral cavity of immunocompromised patients, blood, or tracheal secretion), or yet, two or more patients can be infected in identical anatomical sites (i.e. bronchial washing, urine, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) with a same C. albicans subtype. However, two or more patients also can show infections in corresponding sites (i.e. oral cavity of immunocompromised patients, blood, oropharyngeal secretion, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) by different C. albicans subtypes. Besides, two or more patients also can be infected with identical or different C. albicans subtypes in different anatomical sites (i.e.1. identical subtypes in vaginal secretion, tracheal secretion, and urine; abdominal secretion and spittle; drainage and oral cavity; catheter and healthy saliva - i.e.2. subtypes different in bronchial washing, oropharyngeal secretion, pulmonary secretion, oral cavity of immunocompromised patients, and blood). Complementary studies involving C. albicans sample isolated from several anatomical sites of immunocompetent or immunocompromised patients (before, during and after specifics therapies) and their families or hospital workers must be done in order to establish the sources of C. albicans colonization. The whole-cell proteins profile performed by SDS-PAGE associated with computer-assisted numerical analysis may provide preliminary criteria for taxonomic and epidemiological studies of such microorganisms.

Caracteres moleculares do morango foram avaliados para conhecer cultivares que estão sendo introduzidas no Brasil. Utilizou-se o método do polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD). Os caracteres moleculares com maior poder de discriminação foram os "marcadores" gerados pelos "primers" Operon B8, Operon B19 e Operon G5, que foram eficientes para discriminar as vinte e seis cultivares estudadas. Os dados foram interpretados com o auxílio de dendograma, mapa de bandas, quadro de identificação e chave dicotômica. Foi possível distinguir seis grupos de similaridade, dois deles com cultivares selecionadas no Brasil, sendo um com 'Campinas', 'Agf 80', 'Piedade', 'Jundiaí' e 'Monte Alegre' e o outro com 'Obaira' e 'Mantiqueira'; três grupos com cultivares introduzidas, sendo o primeiro com 'Lassen', 'Reiko', 'Chandler', 'Pajaro', 'Blackmore' e 'Seascape', o segundo com 'Fern' e 'Oso Grande' e o terceiro com 'Florida Belle' e 'Selva' O último grupo reuniu as cultivares 'Dover' e 'Dabreak' junto com 'Princesa Isabel'.

Strawberry cultivars introduced in Brazil were identified through molecular study. The method of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) was used. Molecular characters with larger discrimination power were produced by the primers Operon B8, Operon B19 and Operon G5. These were efficient to discriminate the twenty six studied cultivars. Data were analised through dendogram, bandmap, picture and dicotomic key. Six similarity groups were distinguished: Two with cultivars selected in Brazil, one with 'Campinas', 'Agf 80', 'Piedade', 'Jundiaí' and 'Monte Alegre' and the other with 'Obaira' and 'Mantiqueira'; three with introduced cultivars the first of which 'Lassen', 'Reiko', 'Chandler', 'Pajaro', 'Blackmore' and 'Seascape', the second with 'Fern' and 'Oso Grande' and the third with 'Florida Belle' and 'Selva'. The last group united the cultivars 'Dover' and 'Dabreak' with 'Princesa Isabel'.

O tomateiro é uma olerícola de grande importância econômica e uma das mais suscetíveis a viroses, dentre as quais, a causada pelo vírus do mosaico do tomateiro (ToMV), gênero Tobamovirus, que tem como sintomas mosaico verde claro-escuro nas folhas, afilamento dos folíolos e diminuição da produção, entre outros sintomas. Visando a identificação do ToMV, foram produzidos anticorpos monoclonais (MAbs), testados através de PTA- ELISA ("plate trapped antigen- enzyme linked immunoassay"). O MAb (10.H1) foi utilizado para avaliar a capacidade de identificação do ToMV em testes no campo em plantas de tomate infectadas. O MAb não apresentou reação cruzada com TMV (tobamovirus do mosaico do tabaco) nem com extrato de plantas sadias. O ToMV das amostras foi isolado, purificado e re-inoculado em plantas de tomateiro e de tabaco, para confirmação dos sintomas. Em "immunobloting" o MAb 10.H1 reconheceu somente a proteína referente à capa protéica do ToMV (de 17,5 kDa). A especificidade do MAb 10.H1 pode permitir o diagnóstico precoce desta doença na fase de plântulas, ainda em casa de vegetação, evitando assim a disseminação desta virose no campo.

Tomato is a highly important crop for the world economy, and very susceptible to virus diseases, among them the tomato mosaic tobamovirus (ToMV), which causes light and dark green mosaic in the leaves, decreases yield, among other symptoms. With the aim of early identifying ToMV in biological material, harvested from crop fields, monoclonal antibodies (MAbs) were produced against ToMV. The MAb 10.H1 tested through PTA-ELISA (Plate Trapped Antigen--Enzyme-Linked immunosorbent assay), does not cross-react with TMV (tobacco mosaic tobamovirus) or with proteins extracted from plant sap. The MAb was able to identify ToMV from infected plants. The ToMV was isolated, purified and used to re-inoculate tobacco and tomato plants to confirm the symptoms. In immunoblotting assays the MAb recognizes only the band corresponding to the coat protein of the ToMV (17.5 kDa). The MAb 10.H1 opens the possibility to identify ToMV in tomato seedlings avoiding its dissemination in cropped fields.

Foram obtidos anticorpos monoclonais contra o vírus do mosaico do tomateiro (ToMV) isolado no Brasil. O anticorpo 8G7G2 isotipado como IgG2b (cadeia leve kapa apresentou alta especificidade para o ToMV e baixa reação cruzada com o vírus do mosaico do tabaco (TMV) e poderá ser usado na identificação do ToMV.

Monoclonal antibodies were obtained against Tomato mosaic tobamovirus (ToMV) isolated in Brazil. One antibody (8G7G2) isotyped as IgG2b (kappa light chain) showed strong specificity and very low cross reaction with the Tobacco mosaic virus (TMV). It can be used in identification of tomato mosaic virus (ToMV).

Leveduras contaminantes podem causar grandes perdas em processos fermentativos quando infectam culturas puras e degradam a qualidade do produto final. Estas leveduras podem ser detectadas por diversos métodos mas nenhum deles oferece resultados com a exatidão e precisão necessárias, quando os contaminantes estão em baixa freqüência. Culturas puras contendo um gene marcador podem ser utilizadas para a direta identificação de células e colônias contaminantes. Detecção rápida e fácil é desejada e marcadores morfológicos podem auxiliar na visualização da cultura marcada. O gene da GFP (green fluorescent protein) extraído da Aequorea victoria mostrou-se eficiente para marcação de células, oferecendo ainda uma fácil visualização das populações e tecidos marcados. Para testar este marcador no estudo de leveduras contaminantes, o gene GFP foi usado para construir um vetor, sob o controle do promotor de ADH2, que é reprimido por glicose, não interferindo assim em nenhuma etapa do processo. A inserção do vetor com a GFP (pYGFP3) em leveduras foi um sucesso, demonstrando alta estabilidade e oferecendo com certeza, um novo método com alta eficiência para o controle de contaminantes em processos fermentativos além de servir como marcador destinado a proteção industrial do material genético.

Contaminant yeasts spoil pure culture fermentations and cause great losses in quality and product yields. They can be detected by a variety of methods although none being so efficient for early detection of contaminant yeast cells that appear at low frequency. Pure cultures bearing genetic markers can ease the direct identification of cells and colonies among contaminants. Fast and easy detection are desired and morphological markers would even help the direct visualization of marked pure cultures among contaminants. The GFP gene for green fluorescent protein of Aquorea victoria, proved to be a very efficient marker to visualize transformed cells in mixed populations and tissues. To test this marker in the study of contaminated yeast fermentations, the GFP gene was used to construct a vector under the control of the ADH2 promoter (pYGFP3). Since ADH2 is repressed by glucose the expression of the protein would not interfere in the course of fermentation. The transformed yeasts with the vector pYGFP3 showed high stability and high bioluminescence to permit identification of marked cells among a mixed population of cells. The vector opens the possibility to conduct further studies aiming to develop an efficient method for early detection of spoilage yeasts in industrial fermentative processes.

Foi desenvolvido um método simplificado de isolamento de DNA utilizando substâncias de uso rotineiro facilitando a metodologia e obtendo-se DNA de alta qualidade e integridade quando comparado com os métodos tradicionais. O método descrito não utiliza enzimas líticas, nem banho-maria, e o DNA é obtido em 40 minutos. As quantificações dos DNAs extraídos (medido em D.O. a 260 nm) das dez linhagens de Xanthomonas spp., uma de Pseudomonas spp. e outra de Erwinia spp. mostraram-se de duas a cinco vezes maiores que os métodos conhecidos e suas integridades, testadas em RAPD, apresentaram-se satisfatórias.

A simple DNA isolation method was developed with routine chemicals that yields high quality and integrity preparations when compared to some of the most well known protocols. The method described does not require the use of lysing enzymes, water bath and the DNA was obtained within 40 minutes The amount of nucleic acid extracted (measured in terms of absorbancy at 260 nm) from strains of Xanthomonas spp., Pseudomonas spp. and Erwinia spp. was two to five times higher than that of the most commonly used method.

Este trabalho estudou a imobilização da inulinase de Kluyveromyces marxianus em diferentes suportes, com a finalidade de promover a bioconversão da inulina de Helianthus tuberosus. A inulina de H. tuberosus foi extraída dos tubérculos, desproteinizada e concentrada a 25% de açúcares redutores totais (ART). A inulinase de K. marxianus foi concentrada em evaporador rotativo e imobilizada em quitina (com e sem glutaraldeído), alginato sódico (concentrações de 2 e 4%), pectina, membrana de diálise e sílica de porosidade controlada (SPC). Em quitina obteve-se taxas de imobilização de 73Unidades/g com glutaraldeído e 48 U/g sem glutaraldeído, mas a hidrólise foi baixa em ambos os tratamentos, o equivalente a 2,4% por hora. Em gel de alginato sódico, nas concentrações de 2 e 4%, converteram-se, respectivamente, 12% e 26%, em 1h. A imobilização em pectina foi impossibilitada devido à presença de pectinase no extrato enzimático. A contenção da enzima com o substrato em membrana de diálise proporcionou uma recuperação de 50% do ART em 6h. A SPC apresentou taxa de imobilização de 43 U/g sílica, proporcionando a hidrólise de 43% em 1h, entretanto sua atividade foi se exaurindo rapidamente durante o processo devido à inativação natural da enzima e a conformação dos poros da SPC.

This experiment studied the immobilization of inulinase from Kluyveromyces marxianus in different supports to bioconvert the inulin from Helianthus tuberosus. Inulin was extracted from H. tuberosus tubers, desproteinized and concentrated to 25% total reducing sugars. Inulinase from K. marxianus was concentrated in a rotative evaporator and immobilized onto chitin (with and without glutaraldehyde), sodium alginate (2 and 4%), pectin, a dialysis membrane or controlled-porosity silicate. On chitin, with or without glutaraldehyde, the imobilization rate was 73 and 48 U g-1 respectively. However the hydrolysys of 1g L-1 inulin was very low in both treatments (2.4 % per hour). In sodium alginate gel of 2% and 4% concentration, the conversion was 12% and 26% per hour, respectively. Immobilization onto pectin was not possible due to a high activity pectinase in the enzyme extract. Binding of the enzyme onto dialysis membrane provided recovery of 50% total reducing sugars (42g) in 6h of operation. The controlled-porosity silicate showed an imobilization rate of 43 U g-1 silicate, hydrolyzing 43% of substrate per hour. This activity was, however, exhausted quickly during the process.